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微生物検査における遺伝子検査・PCRとその周辺検査について
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概要
質量分析・target PCR・broad range PCRやfilm arrayなど。gemini AIでなるべく例えを用いて視覚化。研修医のneedに応じて実施したレクチャーを垂れ流すだけ。multiplex PCRなどのpitfallも
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テキスト全文
PCRとその周辺検査の概要と重要性
#1.
PCRとその周辺検査for 微生物 R8年2月
#2.
agenda Introduction (PCRが必要な理由) DNAと核酸増幅法 (PCR) Multiple PCR (commercial base)とpit-fall NGS (next generation sequencing)とその問題点
#3.
感染症の原則 患者 感染部位 原因微生物 抗微生物薬 敵は？ Focusは？
感染症の原則と症状の評価
細菌性髄膜炎の診療ガイドラインと検査方法
迅速性と高感度の検査の必要性
DNAとPCRの基本概念と応用
Multiplex PCRの利点と実施方法
Filmarrayパネルの種類と特徴
髄膜炎パネルの検査結果と解釈
複数陽性の可能性とその影響
16S rRNAとそのデータベース照合の重要性
遺伝子検査の限界と今後の展望
#4.
熱がある、以外のphysical
#5.
ただ・・・ 意識障害があり、症状を訴えることができないなどでは疫学情報や検査所見に頼らざるを得ないし、小児だと髄膜炎のrule out/inは外せない
#6.
発熱 頭痛 項部硬直 が2つでも揃えば、疑わないとならないエマージェンシー 意識障害があればそれだけで鑑別に上がる
#7.
さらに、小児と成人では基準値まで異なる 細菌性髄膜炎の診療ガイドライン：日本神経学会
#8.
糖が減っていても感染とは限らない 術後の出血など(chemical meningitis)でも 糖はしっかりと減る Clin Infect Dis. 2001;32(2):179-85
#9.
細菌性髄膜炎の診療ガイドライン：日本神経学会
#10.
対象の同定（菌の場合） 見た目・コロニー・生化学的特徴による同定 各wellの+/-をdatabaseに照合して、菌同定（この作業を機械がautomaticに実施してくれる）
#11.
培養→結果まで時間がかかる 治療が待てないemergency 迅速性＋高感度の検査の必要性
#12.
持っているタンパク質（種類と組み合わせ）で分類 出てきた波形をdatabaseに照合して、菌同定（この作業を機械がautomaticに実施してくれる） https://www.eiken.co.jp/uploads/modern_media/literature/MM1204_02.pdf
#13.
正確性は担保されるがこれもほとんどの場合 培養が陽性となって初めて可能 さらに細菌以外も・・・
#14.
Microbiol spectr 2024;12(11):e0119224 Pediatr Infect Dis J. 2020;39(4):267-272
#15.
時代は遺伝子
#16.
agenda Introduction (PCRが必要な理由) DNAと核酸増幅法 (PCR) Multiple PCR (commercial base) NGS (next generation sequencing)とその問題点
#17.
DNAとPCR Nature. 1953;171(4356):737-9 Science. 1988;239(4839):487-91
#18.
この微生物かも？ であればその微生物特有の遺伝子配列をシーケンスすれば良い →その微生物が持つことがわかっている（そして他の微生物が有さない特異的な）遺伝子配列の対になるprimerを用いたPCR CGCCTTTAATTCCCCGGCTGA |||||||||||||| [GCGGAAATT]→これがprimer
#19.
target PCR 容疑者を一人一人そこにいなかったかどうかを 調べる手法
#20.
PCR https://www.iph.osaka.jp/s007/020/011/PCR.htmlgoogl
#21.
Clin Microbiol Rev. 2024;37(4):e0002124.
#22.
Clin Microbiol Rev. 2024;37(4):e0002124. EBVやHHV-6/7はいるだけで、原因かどうかはわからないことがほとんど ダニ媒介脳炎の診断にPCRは寄与しない（抗原・抗体検査などを実施する必要性）
#23.
鑑別がある程度絞れるならばそれ等をまとめて検査すれば時間も手間も省ける！ Multiplex PCR
#24.
agenda Introduction (PCRが必要な理由) DNAと核酸増幅法 (PCR) Multiple PCR (commercial base) NGS (next generation sequencing)とその問題点
#25.
Multiplex PCR 容疑者を一気にそこにいなかったかどうかを 調べる手法
#26.
釣り針があって(primer)、それぞれ特定の魚にしか食いつかない特殊な形状のものがあり(複数のprimer)、これを複数同時に投げ込んでいる状況
#27.
Filmarray 呼吸器パネル2.1 https://dev.medicalonline.jp/img/000/114/916/114916_f1_b.jpg 鼻咽頭検体であることに注意が必要
#28.
Filmarray 肺炎パネル https://jaclas.or.jp/Product/index?id=114917 レジオネラが組み込まれたことが強みの一つ 高い感度でどう解釈するか？が今後のポイント 2026年1月保険収載 喀痰・BAL液であることに注意が必要
#29.
Filmarray 髄膜炎・脳炎パネル https://jaclas.or.jp/Product/index?id=114919
#30.
Filmarray 血液培養パネル https://jaclas.or.jp/Product/index?id=114918 菌に限りがある上、結局培養してから ただし、耐性遺伝子も調べることができるのは強み
#31.
Filmarray 消化器パネル https://dev.medicalonline.jp/img/000/114/920/114920_f1_b.jpg 保険適応外 寄生虫や腸炎の菌・ウイルスに絞った項目だが 高感度とどう向き合うか？が課題
#32.
Filmarray 関節感染症パネル https://www.biofiredx.com/wp-content/uploads/BFR0002-0332-01-Lab-CLSI-Document-for-BIOFIRE-JI-Panel.pdf 保険適応外 無菌検体なので髄膜炎同様に有用と考えられている
#33.
髄膜炎パネル Clin Microbiol Infect. 2020;26:281-290 S. pneumoniae S. agalactiae は偽陽性がそれなりに 対象は培養など →ひとまず治療をして 培養その他の検査結果によって 治療を終了するのが合理的？
#34.
髄膜炎パネル Clin Microbiol Infect. 2020;26:281-290 HSV Cryptococcus は偽陰性がそれなりに →抗体検査なども 組み合わせる ことが推奨されるものも
#35.
Filmarray 呼吸器パネル2.1 https://dev.medicalonline.jp/img/000/114/916/114916_f1_b.jpg 鼻咽頭検体であることに注意が必要
#36.
#37.
複数陽性になるのはrare? J Clin Microbiol. 2018;56(6):e01945-17
#38.
日本の研究でも複数陽性となることが示唆 Jpn J Infect Dis. 2021;74:23-28
#39.
PLoS One. 2015;10(9):e0136526 Rhinovirus+RSvirusはかなり多いという結果
#40.
年齢が低いほどco-infection riskは大きい PLoS One. 2015;10(9):e0136526
#41.
Viral shedding期間に関して J Med Virol 2024;96:e29890.
#42.
よくいう16S rRNAって何？ いわゆるbroad range PCR （これまでの説明はtarget PCR) 菌が持つ配列（逆に菌以外は持たない）配列の端から端をsequenceして得られた配列をdata base照合する 細菌だけが有している遺伝子構造(ヒトの細胞ではなく）でそれほど遺伝子が長くない範囲で、多様性が非常に多い部分を調べて、database保存・照合を行うのが効率的 16S rRNA: 原核細胞のリボソームサブユニット内の一部 ＊真菌は有していないrRNAなので16S rRNAのシーケンスでは真菌同定はできない（ITSなどの真菌に特異的な遺伝子を調べる）
#43.
16S rRNA 大体1600bpくらい 内部に超可変領域（多様性を持つ部位）が9個（それぞれ30-100bp程度の長さ）を有する 超可変領域 この辺の配列はほとんどの菌で同じ ＝ここをforward primerに使用 Ex :27F (position 8-27) AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG この辺の配列はほとんどの菌で同じ ＝ここをforward primerに使用 Ex:1492R (position 1492-1512) ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT
#44.
超可変領域 AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG GAG TCT GAA GTC GTT TCC AGA TCC CCT GAT GCC ACC TTG CCA TCT CAA ACT AGG ACC GAG TCT GAA GTC GTT TCC AGA AGG GGA CTA CGG TGG AAC GGT | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 27Fと1492Rの2つのprimerで増幅された配列を合体させると1300-1400くらいの 配列( 16S rRNAは大体全長で１６００bp）が得られる ＊菌によっては27F, 1492Rのprimerの部分の遺伝子配列が違うものも＝ex: Bifidobacterium 他にも63F/1387Rというuniversal primerも使用はされている https://www.jstage.jst.go.jp/article/jim/21/3/21_3_199/_pdf
#45.
得られた配列をdatabase照合 https://www.ezbiocloud.net
#46.
得られた配列をdatabase照合 同じ菌：というのは98.7%以上の一致が必要
#47.
つまり
#48.
agenda Introduction (PCRが必要な理由) DNAと核酸増幅法 (PCR) Multiple PCR (commercial base) NGS (next generation sequencing)とその問題点
#49.
NGS 現場の全てのもの（容疑者も、野次馬も、建物も、取り締まりの警察も）を網羅的に調べて、犯人を探す
#50.
遺伝子を調べるため 死んだウイルスのカケラが残っている場合でも陽性となる(からなずしもon goingの感染を示唆するものではない） 小児なので何度も感染している可能性 （ウイルスはともかく）菌であれば感受性は基本的にはわからない（例外的にRFP耐性遺伝子など遺伝子由来の耐性機序は調べることはできるが） ただ、抗菌薬投与後で培養されない場合や、原因検索という点においては過去とは比べようのない精度で診断が可能となってきている
#51.
ナノデ培養検査ハ必要デスデモ耐性遺伝子マデワカルノデ抗菌薬投与後ノ検査トシテ治療選択ガデキルカモ？？
#52.
Pit fallとまとめ 呼吸器パネルではライノウイルスとエンテロウイルスは区別がつかない 複数ウイルスが出ることはザラにある（死菌・ウイルスのかけらを調べる検査であるため） 陽性となったもののどれが感染を起こしているのかは症状と過去の報告を照らし合わせないとなかなか判断ができない 重複感染が本当にどこまであるのかは判断が難しいので完全な解明にはなかなか至らない（感度が高い故） Prolonged sheddingはウイルスによって異なるがRhino/Entero and Adenoの排出期間は長い 遺伝子検査だけでは解決しない感染症は複数あり、培養及び抗体検査などを組み合わせて判断が必要 検査は保険適応も考慮して（研修医が終わったらお金のことは考えて）
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