#4.
細菌におけるCRISPR-Cas9による 対ウイルス免疫 Deltcheva E, Charpentier E, et al. Nature. 2011;471:602-607.
#5.
細菌におけるCRISPR-Cas9による 対ウイルス免疫 Cas9-RNA複合体によるDNAの切断 （⾼速原⼦間⼒顕微鏡） HNH domain Cleaved DNA Shibata M, Nureki O, et al. Nat Commun. 2017;8:1430. Deltcheva E, Charpentier E, et al. Nature. 2011;471:602-607.
#6.
CRISPR/Cas9によるゲノム編集 Cas9 Jennifer Doudna (University of California, Berkeley) and Emmanuelle Charpentier (Max Planck Institute for Infection Biology) at the 2014 Breakthrough Prize Awards ceremony Jinek M, Doudna JA, Charpentier E, et al. Science. 2012;337:816-821. Feng Zhang (Broad Institute) and George Church (Harvard University) reported that they could export CRISPR-Cas9 to human cells. Science. 2013;339:819-823 and 823-826.
#7.
遺伝⼦機能解明への挑戦 Phenome Genome Positional cloning DNA Sequence PCR Human Genome Project 1980’s - 2003 Mullius Nobel prize 1993 Sanger, et al Nobel prize 1977 Forward genetics (Phenotype-driven) Cell line NGS Model line Ohsumi Nobel prize 2016 for Autophagy Reverse genetics (Genome editing) GFP Shimomura, et al Nobel prize 2008 Knock-in Knock-out Capecchi, et al Nobel prize 2007 Overexpression Yamanaka Nobel prize 2012 for iPS cell Gordon and Ruddle Nobel prize 1980 for transgenic mouse
#8.
ゲノム編集の歴史１ v ゲノムを⾃由に編集することは、⼈類がその存在に気付いた19世紀以来、 ⽣物学者にとっての夢であった。 v ゲノムを操作する試みは古くからあり、古典的な⽅法は⾃然変異マウスの スクリーニング（胸腺を⽋損するヌードマウスなど）や、X線誘導突然変異マウス である。 Mice with ENU-induced mutations v エチルニトロソ尿素（ethylnitrosourea︓ENU）の投与は ⾃然変異の約100倍〜1000倍の確率で点変異を誘発し、 機能喪失型突然変異やアミノ酸置換変異などが得られる。 v このような順遺伝学的⼿法に基づいた表現型スクリーニング はカタログ化され、機能解析に利⽤可能である。 ゼブラフィッシュ トロポニンT遺伝⼦（tnnt2a）変異体 silent heart Wang T, Beutler B, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2015;112:E440-9. Sehnert AJ, et al. Nat Genet. 2002;31:106-110.
#9.
ゲノム編集の歴史２ v 1981年にマウスの胚盤胞からES細胞が樹⽴され、1989年には標的遺伝⼦に対する相同 組換えによるノックアウトマウスが作製された（2007年ノーベル賞）。 ただし、ES細胞が利⽤可能な⽣物種が限られる（ヒト、マウス、ラット）。 v ZFN（2002年）、TALEN（2010年）などの⼈⼯制限酵素を⽤いた⼿法は種を問わずゲ ノム編集を可能にした点では画期的であったが、蛋⽩質合成の⼿間と低い変異導⼊率 のため、⼗分な普及には⾄らなかった。 CRISPRが全て解決してしまった︕ Conventional (HDR in ES cells) CRISPR/Cas9 (genome editing in zygotes) Time to achieve a KO model 2~3 years 2~3 months Oji A, Ikawa M, et al. Sci Rep. 2016;6:31666.
#10.
ゼブラフィッシュにおけるラミン遺伝⼦改変 ① ⼼臓突然死が集積した家系 ③ ラミンA/C遺伝⼦配列アラインメント ヒト ゼブラフィッシュ ヒト変異部位 5ʼ -> -> 3ʼ AGCTGGAGCTGAGCAAAGTGCGTGAGGAGTTTAAGGAG * ******** ***************** * ****** AACTGGAGCTCAGCAAAGTGCGTGAGGACTACAAGGAG CRISPR/Cas9 標的部位 *マッチした塩基 ④ CRISPR/Cas9システムによるゲノム編集 ② 全エクソームシーケンス 発端者 40歳代⼥性 幼⿂ ガイドRNA・Cas9 インジェクション lmna+/+ （野⽣型） ラミンA/C遺伝⼦（LMNA） c.339 dup T (p.K114X fsX1) in silico解析 成⿂ 変異の選択 lmna+/（ヘテロ接合体） ゼブラフィッシュ c.319_322 del CGTG p.E108TfsX5 ⼀細胞期 lmna-/（ホモ接合体） Hayashi K†, Teramoto R†, Nomura A, et al. Cardiovasc Res. 2020;116:2116-2130. †equal contribution
#11.
ゼブラフィッシュを⽤いたラミン遺伝⼦機能解析 ns * 400 200 200 *, p <0.05 +/+ a lmnwt +/- ⼼室 -/- na na lm lm hetero homo 0.6 60 (mm/s) * * ⼼室 20µm *, p <0.05 +/+ lmna +/- lmna lmna -/- lmna Activation time (ms) 0 140 280 het (n=20) -/- lmna homo (n=11) 房室接合部伝導速度 ns 0.40.4 0.0 0 5µm ns * 0.80.8 0.4 40 0.2 20 +/- +/+ lmna wt (n=7) hetero homo * 5µm *, p <0.05 0 0 ⼼房 ⼼腔⾯積変化率 (％) 0 * 400 wt 0.0 (msec) 600 - 0 * ⼼房・核膜 ⼼房活動電位持続時間 lm na + 50 100 100 00 ~ 50 ns 房室 接合部 /+ 150 200 200 100 150 150 ⼼房 * /- ⼼拍数 (bpm) ⼼筋細胞免疫染⾊ lm na + 200 光学マッピング *, p <0.05 +/+ +/- -/- na(n=11) wta (n=7) mhet homo l na(n=20) lm lmn lm na -/ ⼼機能解析 5µm 各600x 緑⾊︓ラミンB1 Hayashi K†, Teramoto R†, Nomura A, et al. Cardiovasc Res. 2020;116:2116-2130. †equal contribution
#12.
CRISPRの応⽤が期待される分野 Agriculture ü 品種改良に要する期間の短縮 ü ⾼い付加価値や新規形質を持つ品種の作出 Personalized medicine, Therapeutics, Drug discovery ü ü ü ü 疾患モデル動物・細胞の作成と創薬への応⽤ 遺伝⼦治療 安全な移植臓器の作成 Gene driveによる動物媒介感染症の撲滅（マラリアなど） Industrial biotechnology ü 微⽣物や植物の品種改良による有⽤物質の⽣産効率改善 ü 微⽣物や植物への新機能付加による有⽤物質の新規⽣産
